通過對(duì)小鼠進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)一年的研究，杜克大學(xué)的研究人員已經(jīng)證明，使用CRISPR基因組編輯技術(shù)進(jìn)行治療可以安全，穩(wěn)定地糾正一種名為杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）遺傳性疾病。

該研究于2月18日在線發(fā)表在《Nature Medicine》雜志上。

2016年，Duke的Rooney家族生物醫(yī)學(xué)工程副教授Charles Gersbach發(fā)表了一項(xiàng)成功使用CRISPR治療遺傳性疾病動(dòng)物模型的方法，其策略有可能轉(zhuǎn)化為人類治療。此后發(fā)表了許多其他的案例，還有更多針對(duì)人類疾病的幾種基因組編輯療法目前正處于臨床試驗(yàn)階段。

Gersbach的研究重點(diǎn)是DMD的小鼠模型，這是由身體無法產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白引起的，肌營養(yǎng)不良蛋白鏈?zhǔn)且环N將肌纖維內(nèi)部與周圍支撐結(jié)構(gòu)結(jié)合的長(zhǎng)蛋白鏈。

抗肌萎縮蛋白由含有79個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的基因編碼，稱為外顯子。如果一個(gè)或多個(gè)外顯子被遺傳突變破壞或刪除，則鏈不會(huì)被構(gòu)建，導(dǎo)致肌肉慢慢撕裂并惡化。大多數(shù)患者在10歲時(shí)就坐輪椅，并且不能超過20歲或30歲出頭。

自2009年以來，Gersbach一直致力于Duchenne的潛在遺傳治療。他的實(shí)驗(yàn)室是早開始關(guān)注CRISPR / Cas9的實(shí)驗(yàn)室之一，這是一種細(xì)菌防御系統(tǒng)的修改版本，可以對(duì)入侵病毒的DNA進(jìn)行定位和切片。他的方法使用CRISPR / Cas9來剪切基因突變周圍的肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子，讓身體的天然DNA修復(fù)系統(tǒng)將剩余的基因重新縫合在一起，以創(chuàng)建一個(gè)縮短但功能性的肌營養(yǎng)不良蛋白基因。

“人們普遍認(rèn)為，基因編輯會(huì)導(dǎo)致性基因改變，”Gersbach說。 “但是，探索可能破壞基因編輯效果的理論可能性非常重要。”因此，這項(xiàng)新研究的目的是探索可能改變基于CRISPR / Cas9的基因編輯的長(zhǎng)期影響的因素。

領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)工作的Gersbach實(shí)驗(yàn)室的博士后研究員克里斯托弗·尼爾森（Christopher Nelson）對(duì)攜帶缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白基因的成年和新生小鼠靜脈內(nèi)施用單劑量的CRISPR療法。在接下來的一年中，研究人員測(cè)量了成功編輯了多少肌肉細(xì)胞以及進(jìn)行了哪些類型的遺傳改變，以及針對(duì)細(xì)菌CRISPR蛋白Cas9的任何免疫應(yīng)答的發(fā)生。

其他研究報(bào)道，小鼠免疫系統(tǒng)可以對(duì)Cas9產(chǎn)生反應(yīng)，這可能會(huì)干擾CRISPR療法的益處。一些研究小組還報(bào)告說，有些人對(duì)Cas9蛋白具有預(yù)先存在的免疫力，這可能是因?yàn)橹敖佑|過細(xì)菌宿主。“好消息是，盡管我們觀察到抗體和T細(xì)胞對(duì)Cas9的反應(yīng)，但似乎都沒有在這些小鼠中產(chǎn)生任何毒性，”作者稱:“這種反應(yīng)也沒有阻止該療法成功編輯肌營養(yǎng)不良蛋白基因并產(chǎn)生長(zhǎng)期蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。”

然而，作者承認(rèn)，小鼠免疫系統(tǒng)的功能通常與人體免疫系統(tǒng)*不同。新生兒DMD篩查目前尚未廣泛開展;大多數(shù)Duchenne診斷發(fā)生在兒童三至五歲時(shí)。為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，Gersbach說在治療期間抑制免疫系統(tǒng)活性可能是一種可行的方法。

此外，研究人員還在研究限制Cas9僅在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)或遞送至肌肉細(xì)胞的潛在策略，這可能會(huì)減少免疫檢測(cè)。

作者此前曾調(diào)查過CRISPR / Cas9的脫靶編輯潛力，無意中修改了基因組中的其他位點(diǎn)，并報(bào)告了可能脫靶位點(diǎn)的小活性。然而，近的其他研究報(bào)道，CRISPR有時(shí)可以在正確的位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，但不能以預(yù)期的方式進(jìn)行。例如，一些研究表明，CRISPR可以切除比預(yù)期大得多的遺傳切片，或者DNA的可以嵌入切割位點(diǎn)。之前在基因組編輯研究中未報(bào)告這些類型的編輯，因?yàn)樗褂玫姆椒▋H檢測(cè)到預(yù)期的編輯。

為了全面地繪制肌營養(yǎng)不良蛋白基因中發(fā)生的所有編輯，作者進(jìn)行了DNA測(cè)序。令人驚訝的是，除了目標(biāo)外顯子的預(yù)期去除之外，還發(fā)生了許多類型的編輯，包括從編碼CRISPR / Cas9系統(tǒng)的病毒載體中高度插入DNA序列。

根據(jù)組織的類型和CRISPR的使用劑量，多達(dá)一半的目標(biāo)編輯導(dǎo)致這些替代序列變化。盡管該結(jié)果令人驚訝，但是非預(yù)期的序列變化似乎不會(huì)影響該CRISPR / Cas9基因編輯方法對(duì)DMD的安全性或功效。

“因?yàn)榧I養(yǎng)不良蛋白基因已經(jīng)存在缺陷，在這種情況下，這些編輯情況不一定會(huì)引起關(guān)注。盡管如此，任何意想不到的結(jié)果都可能會(huì)剝奪你試圖實(shí)現(xiàn)的基因編輯的效率，這支持了設(shè)計(jì)在未來研究中客觀地識(shí)別和減輕替代編輯的方法的重要性。”

“以前的研究表明，其中一些類型的編輯可能會(huì)發(fā)生，但這是使用治療相關(guān)方法對(duì)動(dòng)物模型中這些事件進(jìn)行的綜合測(cè)量之一。展望未來，需要仔細(xì)監(jiān)測(cè)這一現(xiàn)象并更好地理解。避免這些替代編輯并增加預(yù)期頻率的方法編輯對(duì)于大限度地發(fā)揮基因組編輯治療疾病的潛力非常重要。“